3.3. Действие ЭВР на поверхностный потенциал и энергетику тимоцитов.
Помимо разности потенциалов между внутренней и наружной сторонами мембран живых клеток (потенциала покоя), которая обусловлена работой активных ионных насосов и диффузным распределением ионов, существует поверхностный потенциал, который обусловлен фиксированными зарядами мембраны. У всех живых клеток поверхностный потенциал отрицательный. Он зависит от рН среды. С увеличением рН отрицательный заряд поверх- ности возрастает, с уменьшением рН - заряд уменьшается. Дзета-потенциал определяют как потенциал поверхности мембраны вместе с первым слоем противоионов и первым слоем молекул воды, кото- рые остаются связанные поверхностью мембраны при движении клетки в омывающем растворе. То есть дзета-потенциал это потенциал границы скольжения клетки относительно потенциала объема раствора. Стабильность коллоидных растворов и взвесей клеток в значительной мере зависит от величины дзета-потенциал частиц. Для того, чтобы прои- зошло склеивание (аглютинация) частиц, необходимо их сближение на дос- таточное расстояние. Одноименный поверхностный потенциал клеток пре- пятствует их сближению и аглютинации и седиментации. Величина сил от- талкивания возрастает пропорционально величине дзета-потенциала кле- ток. Факторы, которые приводят к уменьшению дзета-потенциала, вызывают усиление коагуляции коллоидов и аглюцинации взвешенных клеток. Величи- на дзета-потенциала снижает при увеличении концентрации ионов в дис- персионной среде. Коагулирующее действие электролитов зависит и от ва- лентности ионов, знак заряда которого противоположен знаку заряда по- верхности частицы. Например, аглютинацию эритроцитов и бактерий уско- ряют соли многовалентных катионов: алюминия, лантана, тория. Стабиль- ность взвешенных клеток зависит не только от величины сил отталкивания определяемых дзета-потенциалом, но и от величины сил сцепления - кохе- зионных сил, склеивающих при их достаточном сближении. Эти силы сцеп- ления определяют критическую величину дзета-потенциала клеток необхо- димую для их уравновешивания. Описанные положения в какой-то мере объясняют механизм действия иммунных веществ - аглютининов. При выработке иммунитета в крови обра- зуются аглютинины способные специфически адсорбирующиеся на поверхнос- ти бактерий, с одной стороны увеличивают силы сцепления, а с другой уменьшают дзета-потенциал клеток, что в конечном итоге приводит к аг- лютинации бактерий. В наших экспериментах дзета-потенциал определяли измеряя скорость движения клеток в электрическом поле приложенном с помощью электроле- тических мостиков к камере Горяева под микроскопом. Средой служил фи- зиологический раствор, который активировали в электроактиваторе "Эспе- ро-1". Использовали как свежеприготовленные католит и анолит, так и католит и анолит в которых требуемые величины рН и окислительно-восс- тановительного потенциала (ОВП) получали добавляя гидроокись натрия или соляную кислоту, или добавляя к католиту анолит. Так как дзета-по- тенциал менялся в зависимости от времени нахождения клеток в активиро- ванных растворах, измерения проводили через различные промежутки вре- мени, пока он не стабилизировался. Тимоциты получали как описано ниже. В таблице 3.7 представлены результаты измерения дзета-потенциала у тимоцитов. В неактивированном физиологическом растворе дзета-потен- циал тимоцитов быстро устанавливается на значении 16,7 мВ при примерно 80% движущихся тимоцитах. 20% тимоцитов, возможно, вследствие прилипа- ния к стеклу камеры Горяева остаются с самого начала неподвижными. При внесении тимоцитов в капельке буфера в растворы католита, также при- мерно 80% тимоцитов начинают движение в электрическом поле, причем на- чальная их скорость быстро уменьшается и устанавливается только через 30-40 минут. Так как невозможно было измерить рН и ОВП в объеме камеры Горяева о количественной стороне результатов говорить строго нельзя, то есть, что такому-то ОВП соответствует такой-то дзета-потенциал. На основании результатов представленных в таблице можно сделать лишь ка- чественный вывод о том, что в растворах католита отрицательный дзе- та-потенциал тимоцитов возрастает, а в растворах анолита падает. Кроме того, в растворах анолита растет процент аглютинирующих тимоцитов в зависимости от времени и ОВП, и в конце концов практически все тимоци- ты аглютинируют - собираются в группы и прилипают к стеклу. Таблица 3.7 Дзета-потенциал тимоцитов крысы в различных электрохими- чески-активированных растворах. --------------T--------------------------------------------------- | | Время инкубации | | Среда +------------T-------------T-----------T-----------+ | | 10 мин. | 20 мин. | 30 мин. | 40 мин. | +-------------+------------+-------------+-----------+-----------+ |Католит | | | | | |физраствора | -39.2мВ | -32.3мВ | -31.4мВ | -31.0мВ | |рН=11,5 | | | | | |ОВП=-800мВ | | | | | | | | | | | |Католит | | | | | |физраствора | | | | | |рН=10.0 | -37.3мВ | -31.7мВ | -30.7мВ | -30.3мВ | |ОВП=-600 | | | | | |(доводили | | | | | | анолитом) | | | | | | | | | | | |Католит | | | | | |физраствора | -25.3мВ | -20.5мВ | -20.2мВ | -20.2мВ | |рН=7.0 | | | | | |ОВП=-400 | | | | | |(доводили | | | | | | НС1) | | | | | | | | | | | |Контроль | | | | | |физраствор | -17.3мВ | -16.7мВ | -16.7мВ | -16.7мВ | |рН=7.0 | | | | | |ОВП=+200 | | | | | | | | | | | |Анолит | | | | | |физраствора | | | | | |рН=7.0 | -16.4мВ | -10.2мВ | -5.7мВ | -5.3мВ | |ОВП=-150 | | | | | |(доводили | | | | | | NаОН) | | | | | | | | | | | |Анолит | | | | | |физраствора | -12,4мВ | -7,6мВ | -3,1мВ | -2,9мВ | |рН=4,0 | | | | | |ОВП=+200 | | | | | | | | | | | |Анолит | | | | | |физраствора | -6,2мВ | Практически все тимоциты | |рН=3,0 | | аглютинироны | |ОВП=+500мВ | | | | | L-------------+------------+-------------+-----------+------------ Примечание: Тимоциты вносили в растворы из буфера выделения с рН=7,4. рНи ОВП в камере Горяева не контролировали. Реакция изолированных митохондрий на различные воздействия на уровне организма не вполне адекватно отражает истинное состояние энер- гетического обмена, т.к. в процессе разрушения клеток, выделения мито- хондрий и их инкубации в стандартных средах зачастую утрачивается вли- яние ключевых внутриклеточных факторов, механизмов контроля и регуля- ции. В связи с этим более достоверную информацию о изменении функцио- нального состояния митохондрий дают эксперименты на уровне суспензии клеток. В последние годы в практике биоэнергетики широкое применение нашли тимациты, как наиболее доступный, легковыделяемый объект. В от- личие от суспензии изолированных митохондрий степень сопряженности ды- хания с фосфорилированием в тимоцитах оценивается следующим образом. Плазматическая мембрана не проницаема для АДФ, но через нее беспре- пятственно проходят такие соединения как 2,4-ДНФ (разобщитель окисли- тельного фосфорилирования, протонофор), олигмицин (ингибитор синтеза АТФ), ротенон, актимицин А и КС (ингибиторы дыхательной цепи). Началь- ная скорость потребления кислорода в тимоцитах соответствует 4 метабо- лическому состоянию (покоя) по Чансу (рис. 3.1.). В присутствии олиго- мицина у хорошо сопряженных митохондрий в тимоцитах наблюдается макси- мальное ингибирование дыхания, которое соответствует именно той части дыхания, что сопряжена с синтезом АТФ. В цитозоле клетка в зависимости от физиологического состояния (гормоны, стресс, патология, температура и т.д.) меняется количество эндогенных разобщителей таких, как свобод- ные жирные кислоты или перекисные соединения и т.д. При последующем добавлении 2,4-ДНФ дыхания тимоцитов максимально активируется, при этом снимается ингибирующий эффект олигомицина, и в этих условиях оце- нивается состояние дыхательной цепи, наличие или отсутствие ингибирую- щий воздействий на ее уровне. В связи с этим нами было исследовано влияние введения ЭВР с раз- личным значением на энергетический метаболизм митохондрий в тимоцитах крыс. Результаты и обсуждение В таблице 3.2 и рис. 3.1.представлены результаты исследования влияния ЭВР на энергетический метаболизм тимоцитов.Введение крысам ЭВР-анолите (+700 мВ) вызывает стимуляцию дыхания в состояние V4 на 53%, а добавление олигомицина вызывает торможение дыхания относительно контроля на 69%. Динитрофенол в клетках этой группы животных стимули- рует дыхание на 42% сильнее чем в контроле, т.е. результаты в целом указывают на то, что эффективность фосфорилирования митохондрий в ти- моцитах примерно в 3 раза слабее, чем в контроле. Можно полагать, что ЭВР-анолит (+700 мв) разобщает дыхание от фосфорилирования, однако ме- ханизм этого разобщения пока неясен. Стимуляция дыхания тимоцитов на 54% при при введении крысам ЭВР-католит (-200 мв) не является следс- твием усилия разобщения окислительного фосфорилирования, т.к. олигоми- цин максимально тормозит скорость потребления кислорода на 73% эффек- тивнее чем в контроле. Это говорит о том, что в условиях этого экспе- римента энергообеспечение тимоцитов данной группы животных идет с наи- большей эффективностью. Данные из таблицы 3.8 о введении крысам ЭВР-католита (-400мв) свидетельствуют о том, что дыхание тимоцитов в состоянии V4 относи- тельно контроля стимулированно на 48% и в присутствии олигомицина ско- рость потребления кислорода увеличена на 53% против контроля,т.е. мож- но констатировать, что эффективность фосфорилирования при такой высо- кой скорости дыхания несколько ниже, чем контрольных клетках, хотя этому, видимо, соответствует общая активация клеток. И в последней серии экспериментов при введении крысам ЭВР-католи- та (-600 мв) мы также наблюдаем значительную стимуляцию дыхания, но с очень низким показателем энегрообеспечения, о чем свидетельствует вы- сокая скорость дыхания в присутствии олигомицина, которая на 75% боль- ше, чем в контроле. Титрование лимфоцитов 2,4-ДНФ дает информацию о количестве ин- тактных полноценных клеток, т.е. о количествах функционирующих дыха- тельных цепочках. Во всех экспериментах количество внесенных в ячейку клеток составляло 10*8 на мл. Степень повреждения клеток в процессе выделения была минимальной, что свидетельствует о стабильности плазма- тической мембраны во всех группах экспериментов. Из таблице видно, что максимально стимулированная скорость потребления кислорода в присутс- твии 2,4-ДНФ обнаружена в тимоцитах крыс, которым вводили ЭВР-анолит (+700 мв), ЭВР-католит (-20мв) и среднее значение (-400 мв). Таким образом, в условиях нашего эксперимента введение ЭВР-като- лита (-200 мв) является наиболее эффективным приемом, повышающим энер- гообеспечение тимоцитов, максимально сопрягающим дыхание и фосфорили- рование и стабилизирующим мембраны на клеточном и субклеточном уров- нях. Существенную активацию окислительного и энергетического обмена вызывает также введение ЭВР с Еп-400 мв. В дальнейшем представляется целесообразным исследовать функциональное состояние изолированных ми- тохондрий в экспериментах. В часности их Са2+ емкость, активность фос- фолипидов А 2, проницаемость для одно- и двухвалентных катионов. Необ- ходимым этапом является также анализ состояния внутриклеточных "депо" кальция, т.к. именно Са2+ реализует состояние активации клеток. Таблица 3.8 Влияние введения животным ЭВР с различным значением Eh на дыхание и энергетический обмен изолированных тимоцитов. ---------T------------------------------------------------------ | | Скорость потребления кислорода, нмоль О2 за 1 мин. | | | на 10 8 клеток | |Вариант +------T------T---------------------------------------+ | опыта | | | Концентрации ДНФ,мкМ | | | V4 |Vолиг +---------T---------T---------T---------+ | | | | 20 | 40 | 80 | 120 | +--------+------+------+---------+---------+---------+---------+ |контроль| 13.0 | 2.6 | 18.0 | 30.0 | 32.0 | 28.0 | | | | | | | | | |физ.р-р | 20.5 | 3.5 | 13.0 | 19.0 | 26.0 | 24.0 | | | | | | | | | |Е +700 | 27.3 | 8.4 | 13.3 | 30.1 | 51.8 | 48.3 | | | | | | | | | |Е -200 | 29.1 | 0.7 | 38.0 | 49.0 | 52.0 | 40.0 | | | | | | | | | |Е -400 | 25.1 | 5.5 | 25.5 | 26.0 | 42.0 | 39.0 | | | | | | | | | |Е -600 | 29.6 | 10.4 | 20.5 | 26.0 | 36.7 | 30.0 | L--------+------+------+---------+---------+---------+----------
![]() Дом. |
![]() Главная |
![]() Отзывы |