3.3. Действие ЭВР на поверхностный потенциал  и энергетику тимоцитов.

     Помимо разности потенциалов между внутренней и наружной сторонами мембран живых клеток (потенциала покоя),  которая обусловлена  работой активных  ионных насосов и диффузным распределением ионов,  существует поверхностный потенциал,  который обусловлен  фиксированными  зарядами мембраны.  У  всех живых клеток поверхностный потенциал отрицательный. Он зависит от рН среды.  С увеличением рН отрицательный заряд  поверх- ности возрастает, с уменьшением рН - заряд уменьшается.      Дзета-потенциал определяют  как  потенциал  поверхности  мембраны вместе с первым слоем противоионов и первым слоем молекул воды,  кото- рые остаются связанные поверхностью мембраны  при  движении  клетки  в омывающем  растворе.  То  есть  дзета-потенциал  это потенциал границы скольжения клетки относительно потенциала объема раствора.      Стабильность коллоидных растворов и взвесей клеток в значительной мере зависит от величины дзета-потенциал частиц. Для того, чтобы прои- зошло склеивание (аглютинация) частиц, необходимо их сближение на дос- таточное расстояние.  Одноименный поверхностный потенциал клеток  пре- пятствует их сближению и аглютинации и седиментации.  Величина сил от- талкивания возрастает пропорционально величине  дзета-потенциала  кле- ток. Факторы, которые приводят к уменьшению дзета-потенциала, вызывают усиление коагуляции коллоидов и аглюцинации взвешенных клеток. Величи- на  дзета-потенциала  снижает при увеличении концентрации ионов в дис- персионной среде. Коагулирующее действие электролитов зависит и от ва- лентности ионов,  знак заряда которого противоположен знаку заряда по- верхности частицы.  Например, аглютинацию эритроцитов и бактерий уско- ряют соли многовалентных катионов:  алюминия, лантана, тория. Стабиль- ность взвешенных клеток зависит не только от величины сил отталкивания определяемых дзета-потенциалом, но и от величины сил сцепления - кохе- зионных сил,  склеивающих при их достаточном сближении. Эти силы сцеп- ления  определяют критическую величину дзета-потенциала клеток необхо- димую для их уравновешивания.      Описанные положения  в  какой-то мере объясняют механизм действия иммунных веществ - аглютининов. При выработке иммунитета в крови обра- зуются аглютинины способные специфически адсорбирующиеся на поверхнос- ти бактерий,  с одной стороны увеличивают силы сцепления,  а с  другой уменьшают дзета-потенциал клеток,  что в конечном итоге приводит к аг- лютинации бактерий.      В наших экспериментах дзета-потенциал определяли измеряя скорость движения клеток в электрическом поле приложенном с помощью  электроле- тических мостиков к камере Горяева под микроскопом.  Средой служил фи- зиологический раствор, который активировали в электроактиваторе "Эспе- ро-1".  Использовали  как свежеприготовленные католит и анолит,  так и католит и анолит в которых требуемые величины рН и  окислительно-восс- тановительного  потенциала  (ОВП)  получали добавляя гидроокись натрия или соляную кислоту, или добавляя к католиту анолит. Так как дзета-по- тенциал менялся в зависимости от времени нахождения клеток в активиро- ванных растворах,  измерения проводили через различные промежутки вре- мени, пока он не стабилизировался. Тимоциты получали как описано ниже.      В таблице  3.7 представлены результаты измерения дзета-потенциала у тимоцитов.  В неактивированном физиологическом растворе дзета-потен- циал тимоцитов быстро устанавливается на значении 16,7 мВ при примерно 80% движущихся тимоцитах. 20% тимоцитов, возможно, вследствие прилипа- ния к стеклу камеры Горяева остаются с самого начала неподвижными. При внесении тимоцитов в капельке буфера в растворы католита,  также  при- мерно 80% тимоцитов начинают движение в электрическом поле, причем на- чальная их скорость быстро уменьшается и устанавливается только  через 30-40 минут. Так как невозможно было измерить рН и ОВП в объеме камеры Горяева о количественной стороне результатов говорить  строго  нельзя, то есть,  что такому-то ОВП соответствует такой-то дзета-потенциал. На основании результатов представленных в таблице можно сделать лишь  ка- чественный  вывод  о том,  что в растворах католита отрицательный дзе- та-потенциал тимоцитов возрастает, а в растворах анолита падает. Кроме того,  в  растворах  анолита растет процент аглютинирующих тимоцитов в зависимости от времени и ОВП, и в конце концов практически все тимоци- ты аглютинируют - собираются в группы и прилипают к стеклу.                                                       Таблица 3.7       Дзета-потенциал тимоцитов крысы в  различных  электрохими-                    чески-активированных растворах. --------------T--------------------------------------------------- |             |                  Время инкубации                 | |  Среда      +------------T-------------T-----------T-----------+ |             |   10 мин.  |  20 мин.    |  30 мин.  |  40 мин.  | +-------------+------------+-------------+-----------+-----------+ |Католит      |            |             |           |           | |физраствора  |  -39.2мВ   |   -32.3мВ   |  -31.4мВ  |  -31.0мВ  | |рН=11,5      |            |             |           |           | |ОВП=-800мВ   |            |             |           |           | |             |            |             |           |           | |Католит      |            |             |           |           | |физраствора  |            |             |           |           | |рН=10.0      |  -37.3мВ   |   -31.7мВ   |  -30.7мВ  |  -30.3мВ  | |ОВП=-600     |            |             |           |           | |(доводили    |            |             |           |           | | анолитом)   |            |             |           |           | |             |            |             |           |           | |Католит      |            |             |           |           | |физраствора  |  -25.3мВ   |   -20.5мВ   |  -20.2мВ  |  -20.2мВ  | |рН=7.0       |            |             |           |           | |ОВП=-400     |            |             |           |           | |(доводили    |            |             |           |           | |  НС1)       |            |             |           |           | |             |            |             |           |           | |Контроль     |            |             |           |           | |физраствор   |   -17.3мВ  |    -16.7мВ  |   -16.7мВ |   -16.7мВ | |рН=7.0       |            |             |           |           | |ОВП=+200     |            |             |           |           | |             |            |             |           |           | |Анолит       |            |             |           |           | |физраствора  |            |             |           |           | |рН=7.0       |   -16.4мВ  |    -10.2мВ  |   -5.7мВ  |   -5.3мВ  | |ОВП=-150     |            |             |           |           | |(доводили    |            |             |           |           | | NаОН)       |            |             |           |           | |             |            |             |           |           | |Анолит       |            |             |           |           | |физраствора  |    -12,4мВ |    -7,6мВ   |    -3,1мВ |    -2,9мВ | |рН=4,0       |            |             |           |           | |ОВП=+200     |            |             |           |           | |             |            |             |           |           | |Анолит       |            |             |           |           | |физраствора  |     -6,2мВ |     Практически все тимоциты        | |рН=3,0       |            |              аглютинироны           | |ОВП=+500мВ   |            |             |           |           | L-------------+------------+-------------+-----------+------------ Примечание: Тимоциты вносили в растворы из буфера выделения с  рН=7,4.              рНи ОВП в камере Горяева не контролировали.      Реакция изолированных  митохондрий  на  различные  воздействия на уровне организма не вполне адекватно отражает истинное состояние энер- гетического обмена, т.к. в процессе разрушения клеток, выделения мито- хондрий и их инкубации в стандартных средах зачастую утрачивается вли- яние ключевых внутриклеточных факторов,  механизмов контроля и регуля- ции.  В связи с этим более достоверную информацию о изменении функцио- нального  состояния  митохондрий дают эксперименты на уровне суспензии клеток.  В последние годы в практике биоэнергетики широкое  применение нашли тимациты,  как наиболее доступный, легковыделяемый объект. В от- личие от суспензии изолированных митохондрий степень сопряженности ды- хания  с  фосфорилированием в тимоцитах оценивается следующим образом. Плазматическая мембрана не проницаема для АДФ,  но через  нее  беспре- пятственно  проходят такие соединения как 2,4-ДНФ (разобщитель окисли- тельного фосфорилирования,  протонофор),  олигмицин (ингибитор синтеза АТФ), ротенон, актимицин А и КС (ингибиторы дыхательной цепи). Началь- ная скорость потребления кислорода в тимоцитах соответствует 4 метабо- лическому состоянию (покоя) по Чансу (рис. 3.1.). В присутствии олиго- мицина у хорошо сопряженных митохондрий в тимоцитах наблюдается макси- мальное ингибирование дыхания,  которое соответствует именно той части дыхания, что сопряжена с синтезом АТФ. В цитозоле клетка в зависимости от физиологического состояния (гормоны, стресс, патология, температура и т.д.) меняется количество эндогенных разобщителей таких, как свобод- ные жирные кислоты или перекисные соединения и  т.д.  При  последующем добавлении  2,4-ДНФ  дыхания  тимоцитов максимально активируется,  при этом снимается ингибирующий эффект олигомицина, и в этих условиях оце- нивается состояние дыхательной цепи, наличие или отсутствие ингибирую- щий воздействий на ее уровне.      В связи  с этим нами было исследовано влияние введения ЭВР с раз- личным значением на энергетический метаболизм митохондрий в  тимоцитах крыс.                     Результаты и обсуждение      В таблице  3.2  и  рис.  3.1.представлены результаты исследования влияния ЭВР на  энергетический  метаболизм  тимоцитов.Введение  крысам ЭВР-анолите  (+700  мВ)  вызывает стимуляцию дыхания в состояние V4 на 53%, а добавление олигомицина вызывает торможение дыхания относительно контроля на 69%.  Динитрофенол в клетках этой группы животных стимули- рует дыхание на 42%  сильнее чем в контроле,  т.е.  результаты в целом указывают на то,  что эффективность фосфорилирования митохондрий в ти- моцитах примерно в 3 раза слабее,  чем в контроле. Можно полагать, что ЭВР-анолит (+700 мв) разобщает дыхание от фосфорилирования, однако ме- ханизм этого разобщения пока неясен.  Стимуляция дыхания тимоцитов  на 54%  при  при введении крысам ЭВР-католит (-200 мв) не является следс- твием усилия разобщения окислительного фосфорилирования, т.к. олигоми- цин максимально тормозит скорость потребления кислорода на 73%  эффек- тивнее чем в контроле.  Это говорит о том, что в условиях этого экспе- римента энергообеспечение тимоцитов данной группы животных идет с наи- большей эффективностью.      Данные из  таблицы  3.8  о  введении крысам ЭВР-католита (-400мв) свидетельствуют о том,  что дыхание тимоцитов в состоянии  V4  относи- тельно контроля стимулированно на 48% и в присутствии олигомицина ско- рость потребления кислорода увеличена на 53% против контроля,т.е. мож- но констатировать,  что эффективность фосфорилирования при такой высо- кой скорости дыхания несколько ниже,  чем  контрольных  клетках,  хотя этому, видимо, соответствует общая активация клеток.      И в последней серии экспериментов при введении крысам ЭВР-католи- та (-600 мв) мы также наблюдаем значительную стимуляцию дыхания,  но с очень низким показателем энегрообеспечения,  о чем свидетельствует вы- сокая скорость дыхания в присутствии олигомицина, которая на 75% боль- ше, чем в контроле.      Титрование лимфоцитов 2,4-ДНФ дает информацию  о  количестве  ин- тактных полноценных клеток,  т.е.  о количествах функционирующих дыха- тельных цепочках.  Во всех экспериментах количество внесенных в ячейку клеток  составляло  10*8 на мл.  Степень повреждения клеток в процессе выделения была минимальной, что свидетельствует о стабильности плазма- тической мембраны во всех группах экспериментов. Из таблице видно, что максимально стимулированная скорость потребления кислорода в  присутс- твии  2,4-ДНФ обнаружена в тимоцитах крыс,  которым вводили ЭВР-анолит (+700 мв), ЭВР-католит (-20мв) и среднее значение (-400 мв).      Таким образом,  в условиях нашего эксперимента введение ЭВР-като- лита (-200 мв) является наиболее эффективным приемом, повышающим энер- гообеспечение тимоцитов,  максимально сопрягающим дыхание и фосфорили- рование и стабилизирующим мембраны на клеточном и  субклеточном  уров- нях.  Существенную  активацию  окислительного и энергетического обмена вызывает также введение ЭВР с Еп-400 мв.  В дальнейшем  представляется целесообразным  исследовать функциональное состояние изолированных ми- тохондрий в экспериментах. В часности их Са2+ емкость, активность фос- фолипидов А 2, проницаемость для одно- и двухвалентных катионов. Необ- ходимым этапом является также анализ состояния внутриклеточных  "депо" кальция, т.к. именно Са2+ реализует состояние активации клеток.                                               Таблица 3.8         Влияние введения животным ЭВР с различным значением               Eh на дыхание и энергетический обмен                      изолированных тимоцитов. ---------T------------------------------------------------------ |        |  Скорость потребления кислорода, нмоль О2 за 1 мин. | |        |               на 10 8 клеток                        | |Вариант +------T------T---------------------------------------+ | опыта  |      |      |       Концентрации ДНФ,мкМ            | |        | V4   |Vолиг +---------T---------T---------T---------+ |        |      |      |  20     |  40     |  80     |   120   | +--------+------+------+---------+---------+---------+---------+ |контроль| 13.0 | 2.6  |  18.0   |  30.0   |  32.0   |  28.0   | |        |      |      |         |         |         |         | |физ.р-р | 20.5 | 3.5  |  13.0   |  19.0   |  26.0   |  24.0   | |        |      |      |         |         |         |         | |Е +700  | 27.3 | 8.4  |  13.3   |  30.1   |  51.8   |  48.3   | |        |      |      |         |         |         |         | |Е -200  | 29.1 | 0.7  |  38.0   |  49.0   |  52.0   |  40.0   | |        |      |      |         |         |         |         | |Е -400  | 25.1 | 5.5  |  25.5   |  26.0   |  42.0   |  39.0   | |        |      |      |         |         |         |         | |Е -600  | 29.6 | 10.4 |  20.5   |  26.0   |  36.7   |  30.0   | L--------+------+------+---------+---------+---------+----------


Дом.

Главная

Отзывы